受损的关节，刷一把“油漆”，即可恢复原状？
假如人体也是一部机器，那么年龄越大，关节软骨磨损就越严重，就像掉漆的汽车一样。
汽车掉漆比较简单，涂上新油漆就可焕然一新。那么，有没有可能给磨损的关节软骨，也设计一种“油漆”，“喷”一下就能“完好如初”？
日前，浙江大学基础医学系教授欧阳宏伟，带领团队研发出一种“关节油漆”，当细胞接触并吸收“油漆”后，就会诞生新的软骨。受损关节也可得到修复，全程只需三四周。
图 | 欧阳宏伟（来源：资料图）
10 月 27 日，相关论文以《仿生关节油漆对猪软骨退变和再生的同时调控》（Biomimetic Joint Paint for Efficient Cartilage Repair bySimultaneously Regulating Cartilage Degeneration and Regeneration in Pigs）为题，发表在 ACS Applied Materials & Interfaces 上，浙江大学医学院附属第四医院的特聘研究员魏威是第一作者，欧阳宏伟担任通讯作者[1]。
图 | 魏威（来源：魏威）
骨关节炎是最常见的关节疾病之一，其临床表现多为关节软骨缺损。作为一种特殊组织，软骨中既没有血管、也没有淋巴，一旦遭遇缺损就很难自我修复。因此在临床治疗上，该疾病正面临着不规则、大面积非全层软骨缺损难以修复的问题。
图 | 相关论文（来源：ACS Applied Materials & Interfaces ）
图 | 相关论文（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
而该团队此次研发的“关节油漆”，有望解决上述问题。以兔实验和猪实验为例，经“油漆”处理后，此前存在缺损的兔和猪的软骨表面，不仅可恢复光滑，糖胺聚糖含量也能保持正常（糖胺聚糖：主要存在于高等动物结缔组织中的一种杂多糖）。
它的原理是通过抑制软骨细胞凋亡、维持软骨细胞表型，并保留部分软骨缺损中糖胺聚糖的含量。据该团队所知，这是第一个用于关节软骨缺损的仿生组分的组织粘合剂。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
“神奇的油漆”
据介绍，“关节油漆”由硫酸软骨素的桥接层、明胶和透明质酸的凝胶层组成，它可通过光固化的方式，快速紧密地粘附在软骨缺损上。
近年来，甲基丙烯酰化明胶一直是生物材料研究的焦点。在该研究中，他们发现其具有光交联特性和生物相容性，故很适合在体内缺陷周围原位形成水凝胶。但是，它不能与软骨表面进行化学结合，因为两者在分子结构上具有相似的基团，很难去产生令人满意的粘附。
如何攻克该问题？连接软骨和水凝胶的桥接聚合物是一种可能的解决方案。
硫酸软骨素是一种广泛存在于天然软骨细胞外基质中的带负电荷的蛋白聚糖。此前研究表明，硫酸软骨素分子可被化学修饰，并与软骨表面丰富的氨基结合，因此它被认为是一种合理的桥接聚合物。
在该团队的设计中，当硫酸软骨素-醛应用于软骨表面时，醛基会和软骨中的氨基发生反应，进而形成亚胺基连接。
粘附 6 小时后，细胞数量明显增加
为了仿生天然软骨组分，该团队将透明质酸纳入甲基丙烯酰化明胶中，借此形成一种半互穿网络结构。在该网络中，前者可保持其生物性能，后者可保持其机械强度。
由于“关节油漆”的弹性性能来自上述两种材料，因此它的压缩模量可由两种材料的压缩模量推断出来，大约为 6.55±0.63kPa。这些压缩试验证实，该“油漆”具备软骨组织工程所必需的弹性特性。
对于软骨再生来说，软骨细胞表型的维持至关重要，为了获悉“关节油漆”的组成成分对于细胞表型的影响，他们在材料表面培养了人软骨细胞，并通过实时荧光定量聚合酶链反应检测基因表达，对其进行测试。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
此前研究表明，透明质酸或硫酸软骨素，或有利于软骨细胞的表型维持。因此，他们采用甲基丙烯酰化明胶结合透明质酸和硫酸软骨素，结果发现这真的能促进软骨细胞基因表达，并提供稳定的力学强度。
详细来说，他们先是研究透明质酸浓度对软骨细胞表型的影响。结果显示，透明质酸的浓度增加时，软骨细胞的 COL2A1 基因表达水平也会增加。
接下来，他们又研究了硫酸软骨素浓度对软骨细胞表型的影响规律，实验组培养 7 天后，聚集蛋白聚糖和 SOX9（一种遗传基因）表达水平均显著升高，这表明在维持软骨细胞表型上，硫酸软骨素-醛起着积极作用。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
由于干细胞的附着可能有利于软骨的再生，因此该研究采用人脂肪来源基质细胞，来研究软骨和“关节油漆”的细胞粘附能力。
与骨髓的间充质干细胞相比，脂肪来源基质细胞在调节炎症上效果更好，因此可给骨关节炎治疗提供更优的细胞来源。
接下来，该团队用“关节油漆”对猪软骨进行预处理，并观察 6 小时后的粘附情况。与天然软骨表面的细胞相比，“关节油漆”表面的细胞数量显著增加。
为进一步研究“关节油漆”的细胞相容性，该团队将细胞培养板进行涂覆，并通过相应方法，去评价“油漆”的生物活性。
分别培养 1 天和 4 天后，他们发现所培养的细胞活力、与正常细胞培养板上的细胞相同，而且死亡细胞也比较少。这些结果表明，“关节油漆”具有高度的细胞相容性，并能促进干细胞粘附。
附着力平均可保留 136 天
为了定量检测“关节油漆”和组织之间的粘接强度，该团队按照美国材料与试验协会的生物医学粘接剂标准，进行了搭接剪切强度和爆裂压力试验。
结果表明，在桥接聚合物硫酸软骨素醛的帮助下，“关节油漆”的破裂压力从 17.6±3.2kPa，“蹭蹭”提升至 34.3±7.3kPa，这个值与该团队此前研发的止血水凝胶相当。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
此外，他们还研究了“关节油漆”在猪软骨体外的尺寸稳定性。具体流程如下：先在猪软骨上形成表面缺损，然后将硫酸软骨素-醛放在缺损部位，5 分钟之后用纱布去除。
接着使用甲基丙烯酸明胶/透明质酸进行涂漆，并暴露在特定紫外光下，以便形成表面光滑的弹性水凝胶。缺损软骨在处理后，弯曲度得到了恢复。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
然后，该团队分离出含有该材料的软骨，并用于进一步研究。接着，采用场发射扫描电子显微镜，他们观察了关节油漆与软骨的强附着力。
扫描电镜图像显示，关节油漆与软骨呈现出清晰、纤细的整合，并且没有任何裂纹。
为了测量这种附着力的保留时间，该团队在温度为4℃的磷酸盐缓冲溶液下，去对关节漆软骨进行摇晃。经观察，涂有“关节油漆”的凝胶膜，其附着力平均可保留 136 天，是无硫酸软骨素醛（甲基丙烯酸明胶/透明质酸）的6倍。
值得注意的是，在 4 个月的评估期内，凝胶膜一直具有弹性、表面光滑，并且完全附着在软骨上。
在 8 周的植入期内完全降解
为了验证“关节油漆”的生物相容性和生物降解性，该团队把硫酸软骨素醛桥接层，涂上甲基丙烯酸明胶/透明质酸水凝胶膜，并植入大鼠皮下。然后分别在 1 周、2 周、4 周、8 周后收集植入物及其周围组织。
为定量地检查降解情况，植入物被小心地从组织中取出，并在冷冻干燥后称重。结果发现，“关节油漆”会随着时间推移而降解，并在 8 周的植入期内完全降解。
接着，该团队将苏木素-伊红染色液，用在植入物、及其周围组织的组织学切片上，借此来评估生物相容性。
在植入物的第一周内，他们在周围观察到炎症细胞，但这些细胞会随时间逐渐消失，宿主组织也会随着种植体的降解而逐渐生长。
这一观察结果表明，在植入开始时会产生急性炎症反应，但会随着时间消退，这表明“关节油漆”具有可生物降解和生物相容性。
软骨看起来很健康，与假手术组相似
为研究关节漆的修复效果，该团队研究了一种公认的模型动物新西兰白兔，他们把“关节油漆”用于 2mm×6mm 宽、0.2mm 深的缺陷上，并通过光聚合在软骨表面，进行原位固化。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
然后，分别在涂抹“关节油漆”6 周和 12 周后进行按组检查，并通过肉眼观察和组织学分析进行评估。
在“关节油漆”治疗组中，一个新形成的组织纤维填充了大部分缺损，软骨看起来很健康，与假手术组相似。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
此外，经“关节油漆”处理后，软骨细胞凋亡明显减少，这说明它可阻止损伤软骨中的软骨细胞凋亡。
（来源：ACS Applied Materials & Interfaces）
为了更好地模拟人类软骨的情况，该团队使用了一个更大的动物——利用猪模型来进一步研究“关节油漆”对急性软骨缺损的保护功能。
结果发现，“关节油漆”处理组产生了缺损部位的填充组织，而未处理组的缺损仍然明显可见。
此外，体外细胞研究也表明，“关节油漆”与人类干细胞高度兼容，这表明其在体内使用时具有再生潜力。
据介绍，欧阳宏伟是浙江大学求是特聘教授，国家自然基金创新研究群体项目负责人，中国生物医学工程学会组织工程与再生医学分会主任委员，美国医学与生物工程院 Fellow，国际骨科联合研究学会 Fellow，长期从事运动系统损伤修复与再生研究，Google 学术 h 指数 62，i10 指数 130，入选斯坦福大学发布的“2020 全球前 2% 顶尖科学家榜单”。
他曾制定了国家行业标准 2 项和卫生部管理规范 1 项，在国内最先开展了临床关节软骨组织工程移植，开展了蚕丝医用材料国际首个临床多中心随机对照研究并获得国内首个蚕丝材料的第三类医疗器械证。以第一完成人获省部级科技奖励一等奖 3 项。2012 年带领团队创建国内第一个生物医学专业并入选首批国家级一流本科专业建设点。
本次担任论文第一作者的魏威，本科毕业于南京理工大学高分子材料与工程系，2011 年保送南京理工大学硕博连读研究生。2016-2017 年在哈佛大学医学院进行联合培养博士研究生学习，师从阿里·卡德姆侯赛尼（Ali Khademhosseini）教授，主要参与纳米材料、骨组织再生、3D 打印等课题研究。2018 年至 2020 年在欧阳宏伟教授课题组从事博士后研究，主要课题为骨关节炎中软骨缺损的再生以及组织粘附性水凝胶的开发，Google 学术 h 指数 25，i10 指数 29。2021 年起在浙江大学医学院附属第四医院任特聘研究员。
谈及未来，该团队表示将继续深入“关节油漆”的研究，并积极推动该项目的转化，在即将开始的第一届全国博士后创新创业大赛上，“关节油漆”的项目也将作为总决赛入围项目之一进行路演。该团队希望打造人体“零配件”的 4S 店，修复机体的损伤。
-End-
参考：
1、Wei Wei. et al.ACS Appl Mater Interfaces. 2021Nov 24;13(46):54801-54816. doi: 10.1021/acsami.1c17629
